PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO 23/04/2017
En la actualidad, la mayoría de los medios de cultivo se comercializan ya
preparados y esterilizados.
Sin embargo, existe la posibilidad de comprarlos liofilizados. En estos casos la
preparación del medio de cultivo se reduce sencillamente a pesar la cantidad
deseada del mismo y disolverla en agua destilada siguiendo las instrucciones del
fabricante. Posteriormente se esterilizan, generalmente por calor húmedo en el
autoclave, excepto aquellos que contengan componentes termolábiles, que se
esterilizan por filtración.
Según el recipiente en que se vaya a distribuir, se seguirá el siguiente orden:
En tubo: se reparten en los tubos antes de ser esterilizados. Se reparten
2-4 ml en caso de medios líquidos y unos 6-8 ml cuando sean tubos de
agar inclinado. En este último caso, tras la esterilización, se dejarán
apoyados en una superficie inclinada hasta que solidifiquen en forma de
slant o punta de flauta.
En placa de Petri: se esterilizan en botella o matraz Erlenmeyer. Una vez
esterilizados, se deja enfriar sin que llegue a solidificar para
posteriormente repartirlos en las placas en condiciones de esterilidad. Se
almacenarán en posición invertida.
Objetivos:
Preparar medios de cultivo como soporte y fuente de nutrientes para el desarrollo de los microorganismos
Fundamento
El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de los microorganismos. La composición precisa dependerá de la especie que se quiera cultivar, porque las necesidades nutricionales varían considerablemente. Hay microorganismos muy poco exigentes que crecen bien en medios de laboratorio normales y microorganismos muy exigentes que necesitan determinadas sustancias como vitaminas, suero o sangre para crecer.
Durante las prácticas se van a manejar medios de cultivo de composición muy variada y de tres tipos diferentes en cuanto a consistencia:
Medios sólidos: Se pueden preparar a partir de medios líquidos a los cuales se les añaden agentes solidificantes como agar, gelatina o sílica gel. Se utilizan con frecuencia en el aislamiento y mantenimiento de los microorganismos en el laboratorio. Ej. Agar nutritivo.
Semisólidos
Líquidos: Usualmente se denominan caldos ya que contienen los nutrientes disueltos en agua. Permiten obtener suspensiones con un elevado número de microorganismos. Ej. Caldo nutritivo
Este último aspecto es importante a la hora de la preparación de los mismos. Aunque los medios artificiales o sintéticos se pueden preparar a partir de sus componentes individuales, se pueden adquirir comercialmente como medios deshidratados a los que solamente hay que añadir la cantidad de agua necesaria. El fabricante indica la composición, la caducidad, y la cantidad que debe pesarse por cada litro a preparar e incluso como debe esterilizarse.
La preparación de medios de cultivo a groso modo consistiría en: Se siguen las instrucciones del rótulo del medio de acuerdo a la cantidad a preparar. Se transfiere el medio a u Erlenmeyer y se agrega la cantidad de agua destilada establecida. Con ayuda de un vigilante se disuelven los grumos que puedan formarse y se lleva la suspensión a baño maría hasta que el medio se torne transparente, se cubre el Erlenmeyer con un tapón de algodón (torunda) envuelto en gasa. Se cubre la torunda con material impermeable y se esteriliza en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. Si se utiliza de inmediato, dejar enfriar a temperatura alrededor de 45ºC. En caso de que el medio solidifique, fundirlo nuevamente a baño maría antes de su uso.
En el caso del caldo Mc Conkey, se siguen las instrucciones del rotulo, y se distribuye el caldo colocando 10 ml en tubos de ensayo de 20 y 10 ml en tubos de ensayo de 50. Se coloca previamente en los tubos una campana de Durham invertida. Se tapan los tubos y se esterilizan en autoclave durante 15 minutos a 121ºC.
TÉCNICA Y PROCEDIMIENTO:
- Limpiar superficie, antes y después, con agua y lejía.
- Cálculo y peso de agar.
- Medir agua en probeta.
- Mezclar en el Erlenmeyer (microondas).
- Autoclave.
1º Realizar los cálculos necesarios para conocer la cantidad de AGAR que hay que pesar
K.I.A:
1000ml ________54,5g
70ml __________ x
2º Colocaremos el papel, para evitar manchar la superficie sobre la que vamos a trabajar
3º Colocaremos todos los materiales a utilizar sobre dicho papel
4º Mediremos el agua destilada que vamos a necesitar para la realización de medio, para esto y en este caso utilizaremos una Probeta
5º Nos dirigimos hacia el peso, asegurándonos de que este éste encendido y limpio, colocaremos un vidrio de reloj sobre el peso, a continuación pulsaremos el botón “Tarar”, a partir de aquí ya podremos proceder a verter lentamente con ayuda de una espátula el AGAR que necesitamos sobre el vidrio de reloj, hasta conseguir la cantidad necesaria, una vez obtenida dicha cantidad los restos que se encuentren en la espátula no podremos volver a verterlos sobre el bote de soluto, lo verteremos sobre un vaso de precipitado, que usaremos para los restos. Recordad cerrar bien el bote de AGAR para evitar que este se derrame y/o contamine.
6º A continuación nos volvemos a dirigir a la mesa de trabajo que dejamos preparada anteriormente, con ayuda de la misma espátula usada con anterioridad verteremos el AGAR pesado en un matraz Erlenmeyer que previamente le habremos añadido un poco del agua que teníamos preparada en la Probeta
7º Una vez que hemos añadido todo el AGAR sobre el Matraz Erlenmeyer terminaremos de añadir el agua destilada de la Probeta.
8º Ya tenemos la preparación del AGAR casi terminada, a continuación después de haber mezclado el AGAR (gelificánte) lo moveremos con una varilla agitadora para eliminar los grumos.
9º Una vez que podemos dar la mezcla por terminada tendremos que calentarla hasta su ebullición, esto se realizara en un microondas (tener cuidado ya que esto tarda muy pocos segundos)
10º Sacamos el medio del microondas, y lo añadimos en uno de estos materiales según la finalidad del medio, en caso de que su estado sea liquido o semisólido en tubo tendremos que añadir el medio con ayuda de un pipeta graduada con su pimpum correspondiente en tubos de ensayos (colocados en gradillas metálicas) que posteriormente esterilizaremos en autoclave y tras su esterilización lo colocaremos en tubo s de ensayo de tal forma que al enfriarse se nos quede con la forma que necesitamos para la realización de la prueba a la que está destinada ese tipo de AGAR. En otros casos en los que el estado final del medio sea semisólido/solido tendremos que colocar el medio en una placa Petri, que solo tendremos que dejar enfriar.
11º En todos estos casos es importante rotular el material, ya sea el tubo de ensayo como la placa Petri, para así conocer el medio de cultivo y que no podamos confundirnos a la hora de realizar el cultivo.
- AGAR (polvo)
- Agua destilada
- Placa Petri o tubos de ensayo
- Gradilla metálica para los tubos de ensayo
- Vidrio de reloj
- Probeta
- Matraz Erlenmeyer
