MEDIOS DE CULTIVO  31/03/2017

En el laboratorio existen dos técnicas básicas para trabajar con
microorganismos: el cultivo para crecerlos y la microscopía para verlos.
Para poder trabajar con microorganismos lo primero que tenemos que hacer es
crecerlos, cultivarlos en medios de cultivo, para poder así obtener una gran
cantidad de microbios, poder aislarlos y tenerlos en cultivo puro, para su
posterior estudio. Los medios de cultivo son materiales alimenticios, naturales
o artificiales, que contienen los nutrientes y las condiciones físico-químicas
necesarias para el desarrollo y crecimiento de los microorganismos.

Robert Koch fue el primero que cultivó bacterias en medios sólidos. Primero
empleó rebanadas de patata, pero se le contaminaban fácilmente con hongos
ambientales. Luego empleó gelatina para solidificar los medios, pero algunos
microorganismos son capaces de degradarla. Además, la gelatina no se mantenía
sólida a 37ºC, que es la temperatura a la que crecen la mayoría de los patógenos
humanos. La idea de emplear agar la sugirió Fanny Eilshemius, la mujer
de Walter Hesse, unos de los colaboradores de Koch, en 1882. Fanny
empleaba agar para solidificar las mermeladas y Walter se llevó el invento de la
cocina al laboratorio. La ventaja del agar es que permanece sólido a 37ºC, la
mayoría de las bacterias no la degradan y además es trasparente, lo que facilita
el examen de las colonias bacterianas. Llevamos más de 120 años usando el agar
para preparar los medios y obtener cultivos puros bacterianos. Algo tan sencillo
como los medios sólidos con agar en placas de Petri ha sido esencial para el
desarrollo de la microbiología.


UTILIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

a. Separación y aislamiento de microorganismos presentes en una muestra.
b. Paso previo para la identificación de un microorganismo problema. Se
pueden obtener cultivos puros (axénicos) a partir de colonias aisladas.
c. Conocer el tipo de metabolismo: en función de los nutrientes que utiliza
o los metabolitos que produce.
d. Estudios macroscópicos, es decir, de las características de las colonias en
medio sólido.
e. Realización de antibiogramas.
f. Pruebas de concentración mínima inhibitoria (CMI)
g. Conservación de especies


COMPOSICIÓN DE UN MEDIO DE CULTIVO

1. Nutrientes energéticos:
a. Fuente de carbono: puede aparecer como sustancias muy sencillas
(ácido acético, alcohol, citrato sódico…), de monosacáridos y
disacáridos (glucosa, lactosa…) o en forma más compleja (almidón). El
uso de unas moléculas u otras es muy útil para su identificación
bioquímica y clasificación taxonómica.
b. Fuente de nitrógeno: es menos energética pero necesaria. La proporcionan
las proteínas, péptidos o aminoácidos. Suele incluirse en forma de gelatina,
extractos de carne, peptonas...

2. Nutrientes no energéticos:
a. Agua: indispensable, ha de ser destilada para no alterar el equilibrio de
sales. En los medios con agar recién preparados, la evaporación o
tiempo de almacenamiento excesivo puede reducir la actividad del agua
de la superficie, produciendo colonias más pequeñas o inhibiendo el
crecimiento.
b. Sales minerales: proporcionan equilibrio osmótico para evitar la lisis o
deshidratación de los microorganismos, y aportan micronutrientes. Se
añaden sales de sodio, potasio, magnesio, hierro…
c. Fuente de azufre: generalmente en forma de sulfatos, tiosulfatos y
aminoácidos azufrados como la metionina.
d. Fuente de fósforo: en forma de fosfatos.

3. Otros componentes:
a. Agentes solidificantes: en los medios sólidos y semisólidos. El agar, un
polisacárido obtenido de algas rojas, es el más usado. La gelatina y la
albúmina apenas se usan pues son consumidos por la mayoría de los
microorganismos.
b. Tampones: para estabilizar el pH
c. Indicadores de pH: según el pH del medio tienen un color u otro (rojo
neutro, azul de bromotimol, fenolftaleína…)
d. Agentes reductores: para promover la anaerobiosis en el medio, se usa
tioglicolato sódico, ácido ascórbico, cisteína…
e. Factores de crecimiento: para ciertas especies se necesitan ciertos
compuestos especiales, como vitaminas, purinas o pirimidinas.
f. Factores inhibidores: impiden el crecimiento de algún tipo de
microorganismos. Existen muchos sustratos de este tipo:
 Inhibidores de Gram-: azida sódica
 Inhibidores de Gram+: eosina-azul de metileno, cristal violeta, verde
brillante
 Inhibidores de microorganismos no entéricos: sales biliares
 Antibióticos.


TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

Según su consistencia
a. Líquidos (caldos): no contienen agar, se preparan en tubos. Favorecen
el desarrollo y multiplicación de las bacterias por la fácil difusión de los
nutrientes.







b. Sólidos: contienen agar en una proporción de 15-17 g/l. También pueden
tener gelatina o albúmina. Se preparan en tubo inclinado o placa. El
crecimiento es más difícil, son muy buenos para aislamiento, morfología
de colonias, producción de hemólisis…






c. Semisólidos: con agar entre 3-5 g/l, suelen ir en tubo. Para movilidad de
microorganismos.







Según su composición
a. Definidos: su composición química es totalmente conocida.
b. Complejos: compuestos por mezclas de extractos de materiales naturales
cuya composición química exacta no es conocida. Los clásicos estaban
compuestos por clara o yema de huevo, patata, suero sanguíneo… En la
actualidad se combinan los extractos naturales (levadura, carne, peptonas
hidrolizadas…) con adición de constituyentes químicamente definidos.
Según su utilidad
a. Medios generales o comunes: apropiados para el crecimiento de la
mayoría de microorganismos poco exigentes. Ejemplos: caldo nutritivo,
caldo triptona-soja (TSB), PCA...
b. Medios enriquecidos: se les añade ciertos productos para favorecer a
microorganismos más exigentes (sangre, suero, glucosa). Ejemplos: agar
lactosado, agar sangre...
c. Medios selectivos: llevan sustancias enriquecedoras e inhibidoras que
permiten el desarrollo de algún tipo microbiano. Por ejemplo, el agar bilis
verde brillante.
d. Medios diferenciales: incluyen algún componente que da información
adicional por medio de reacciones bioquímicas (azúcares, indicadores de
pH, colorantes).
Muchos de los medios son tanto selectivos como diferenciales, como el
agar MacConkey o el agar Levine, selectivos para Gram- y diferencial entre
fermentadores de lactosa y no fermentadores.
e. Medios de transporte y conservación: para asegurar la viabilidad de los
microbios desde la toma de muestras hasta la siembra en laboratorio, envío
de unos laboratorios a otros y mantenimiento de cepas durante largos
periodos de tiempo. Son medios no nutritivos que inhiben las reacciones
enzimáticas autodestructivas y evitan los efectos letales de la oxidación.
Los más usados son el Stuart, Amies y Cary-Blair.