TINCIÓN DE GRAM                09/05/2017



Fundamentos de la técnica:
Es el proceso por el cual las moléculas de un colorante se adsorben a una superficie.
El uso de colorantes permite cambiar el color de las células de los microorganismos y poder realizar la observación en microscopio óptico.

Dado que las bacterias son casi incoloras, no presentan contraste con el medio en el cual se encuentran suspendidas y no pueden observarse claramente sin algún tratamiento previo.
Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram, quien la desarrolló en 1844. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, Gram positivas y Gram negativas (en este caso, los términos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga eléctrico, sino simplemente designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias).
Descripta en forma breve, la secuencia de la tinción es la siguiente: el Frotis fijado con calor se tiñe 1 min con Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con solución Yodada durante 1 - 2 min.  y se lava de nuevo con agua, decolorar con mezcla alcohol etílico/acetona. Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 1 – 2 min. Lavar y secar.
Las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo así como para prevenir la lisis osmótica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el Peptidoglicano. La pared de la célula Gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de Peptidoglicano así como algo de ácido teicoico.
Generalmente, 80%-90% de la pared de la célula Gram-positiva es peptidoglicano.
La pared de la célula Gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la célula Gram-negativa es peptidoglicano

Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen, primero con una solución de cristal violeta (otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las células, tanto las Gram positivas como las Gram negativas, están teñidas de azul.
El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo-yoduro potásico. El ingrediente activo es aquí el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las células Gram positivas como las Gram negativas se encuentran en la misma situación.
Se lleva a cabo después la decoloración, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos (Gram positivos) no se decoloran, mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de células está por tanto en su resistencia a la decoloración; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias Gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipídico y disuelve la membrana exterior de la pared de la célula (y también puede dañar la membrana citoplasmática a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la célula se decolora. Las células Gram positivas, a causa de sus paredes celulares más espesas
(Tienen más peptidoglicano y menos lípido), no son permeables al disolvente, provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Después de la decoloración las células Gram positivas son todavía azules, pero las Gram negativas son incoloras.
Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules.


Técnica y procedimiento:

Colocaremos el papel, para evitar manchar la superficie sobre la que vamos a trabajar
Colocaremos todos los materiales a utilizar sobre dicho papel, la Placas Petri de la que partimos estará colocada con la tapadera boca abajo para que a la hora de cogerla sea mucho más sencillo y haya menos riesgo de contaminación Recordad poner agua en el recipiente para que el materias no adquiera el tono del colorante.
A continuación encenderemos el mechero Bunsen para crear un ambiente estéril y para esterilizar el asa de siembra, esta la deberemos esterilizar con dicho mechero antes de realizar la toma de muestra de la colonia y después de haber colocado la colonia en el Porta.
Ya nos disponemos a tomar la muestra de la colonia que se encuentra en la placa Petri cultivada, una vez que abrimos la placa Petri y antes de coger la colonia, como el asa de siembra ha sido quemada con anterioridad deberemos enfriarla en una esquina del AGAR para no quemar la colonia.
Ya tenemos la colonia en el asa de siembra
Colocar una gota de suero fisiológico en un Porta, colocar la colonia en dicha gota y disgregar.
Cuando ya tenemos la colonia bien disgregada por el porta, calentaremos el porta con el mechero Bunsen con el objetivo de fijar las colonias y que no se mueva.

Comenzamos con la utilización de reactivos
Primero añadimos un colorante a la muestra, en este caso será cristal de violeta y lo dejamos 1 minuto
Enjuagamos con agua destilada hasta que hayamos retirado todo el colorante
Añadimos Mordiente (Lugol) para fijar el color del colorante que le vamos a añadir posteriormente y lo dejamos 1 minuto.
Enjuagamos con Acetona y posteriormente con agua destilada
Le añadimos el ultimo reactivo, la Fucsina Básica, la dejaremos un minuto y enjuagaremos con agua del rifo.
A continuación dejaremos secar la muestra y le haremos un análisis macroscópico, en lo que se incluye observar la muestra en el microscopio.

Aparatos y materiales:

Puente de tinción

Recipiente para poner puente de tinción

Porta

Agua destilada

Agua del grifo

Asa calibrada

Mechero Bunsen

Suero fisiológico

Reactivos:

Cristal de Violeta

Mordiente (Lugol)

Fucsina Básica