Fundamentos de la técnica:
Este método se fundamenta en determinar el número y tipo de microorganismos presentes en una muestra de agua de proceso, por medio de la filtración de la misma a través de una membrana filtrante con poros de tamaño adecuado (0,45 μm de diámetro), la consiguiente retención de los microorganismos sobre dicha membrana y el cultivo de los mismos en diferentes agares de acuerdo al tipo de microorganismo.
MÉTODOS DIRECTOS
Recuento en placa
Determina el número de células microbianas viables que desarrollan colonias en el medio de cultivo usado. Cada colonia se forma a partir de una sola célula o de pequeños agregados, por lo que se habla de UFC (unidades formadoras de colonia).
Se realizan diluciones seriadas (con un factor común, 1/10 ó 1/100) de la muestra y se cultiva 1 ml de cada una de ellas. La siembra puede ser en césped o en masa, aunque en masa hay muchos microorganismos que no aguantan la temperatura.
Se incuba 24 h y se hace el recuento. Se recomienda contar las placas que presenten entre 30 y 300.
Por tanto, para saber cuántas UFC/ml hay en la muestra original:
UFC/ml =nº colonias ∙ dilución
v (ml)
Recuento por filtración
Para muestras líquidas o solubles con una cantidad de microrganismos muy baja, se hacen pasar unos 100-500 ml a través de un filtro de membrana estéril con un diámetro de poro de unos 0,45 μm. El filtro se cultiva en la superficie de un medio en placa de Petri y se incuba. Los filtros están reticulados, se contarán las colonias desarrolladas y se calcula el número de UFC/ml.
Este método es muy usado para el recuento de coliformes en análisis de alimentos y aguas.
Método del número más probable
Es un método que se basa en una estimación estadística, una distribución de tipo Poisson. Se cultivan varios tubos con distinto volumen de muestra (p.ej. 5 tubos de 0,1 g, 5 de 0,01 g y 5 de 0,001 g). Tras la incubación se anotan el número de tubos que muestran crecimiento (o una determinada reacción en el medio) y se compara en tablas que indican que el 95 % de las veces la muestra tendrá entre
unos límites inferior y superior de UFC/100 ml, indicando cuál es el número más probable.
Se usa para muestras con cargas microbianas bajas, en análisis industriales y de aguas.
Recuento directo al microscopio
Se usan portaobjetos especiales, que tienen un retículo para recontar.
MÉTODOS INDIRECTOS
Recuento por comparación con la escala de MacFarland
Para diluciones seriadas de cultivo en medio líquido. Se compara la turbidez con la escala de MacFarland, una serie de tubos de cloruro de bario precipitado con ácido sulfúrico de turbidez creciente. Esta escala indica el número estimado de bacterias/ml en función de la turbidez del tubo.
Recuento por turbidimetría
También para medios líquidos, se usa el espectrofotómetro y se estima el número de bacterias/ml en función de la luz que atraviesa la muestra (transmitancia) o absorbida (absorbancia).
Previamente se requiere realizar una curva patrón conocida, para lo cual pueden usarse los tubos de la escala de MacFarland.
Aparatos y materiales:
Equipo de Filtración
Membrana filtrante
Ampolla de agua estéril para despegar filtro
Pinzas
Mechero Bunsen
Alcohol
Pinzas para sujetar el equipo
Agua (de la que partimos para filtrar)
Placa Petri estéril con AGAR Nutritivo o ENDO
Técnica y procedimiento:
Colocaremos el papel, para evitar manchar la superficie sobre la que vamos a trabajar
Colocaremos todos los materiales a utilizar sobre dicho papel, la Placas Petri que usaremos al final de la práctica estará colocada con la tapadera boca abajo para que a la hora de cogerla sea mucho más sencillo y haya menos riesgo de contaminación.
Preparamos Equipo de filtración
Coger 100ml de Agua de la que queremos conocer las bacterias que tiene
A continuación encenderemos el mechero Bunsen para crear un ambiente estéril y para esterilizar las pinzas con las que cogeremos el filtro, esta la deberemos esterilizar con dicho mechero antes de coger el filtro, ya este podríamos contaminarlo
En una placa Petri vacía (sin AGAR) colocamos la ampolla de agua estéril y metemos dentro la membrana filtrante para que este se separe (con ayuda de unas pinzas)
A continuación coloremos la membrana filtrante en el equipo de filtración.
Colocar la campana del equipo y la pinza que la sujeta
Verter los 100ml de agua en la campana y encender el equipo.
El agua comenzará a filtrarse
Cuando ya esté el agua filtrada retiramos el filtro del aparato de filtración y lo metemos en un AGAR ENDO o Nutritivo, que posteriormente meteremos en la estufa para que crezcan los microorganismos
Sacamos el AGAR de la estufa y le hacemos un análisis macroscópico, en el que aparte de observar las colonias, tendremos que contarlas con el “contador de colonias”
CONTADOR DE COLONIAS
Un contador de colonias es un instrumento utilizado para contar colonias de bacterias o de otros microorganismos que crecen en una placa de agar. Los primeros contadores sólo eran superficies iluminadas sobre las que se colocaba la placa, con las colonias marcadas con un rotulador en la superficie externa de la placa mientras el operador realizaba el recuento manual. Los contadores más recientes intentan contar las colonias por vía electrónica, mediante la identificación de áreas individuales de oscuridad y luz, de acuerdo a los umbrales definidos por el usuario, contando los puntos en los que se aprecia contraste, o de modo automático mediante registro electrónico tras presionar con cualquier tipo de marcador
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