SIEMBRA DE MICROORGANISMOS           02/05/2017

Objetivo:
Identificar el uso de medios de cultivo de acuerdo al microorganismo a estudiar

Fundamento:
La siembra o inoculación de un medio consiste en introducir artificialmente una
porción de muestra, llamada inóculo. Posteriormente el medio se incuba a una
temperatura adecuada para el crecimiento.
Para la siembra se pueden usar distintos instrumentos: asa de siembra, aguja de
siembra, hisopo, pipeta estéril y asa de Digralsky.

Las reglas fundamentales para efectuar la siembra exigen:
 Que se efectúen asépticamente
 Que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar estén esterilizados
 Que se realicen solo los manipuleos indispensables
 Que se trabaje fuera de toda corriente de aire. De ser posible utilizando un
mechero o bien Flujo laminar.




Procedimiento general de toma de inóculo:
1º. Colocar el material próximo al mechero encendido, creando un
espacio estéril por la ascensión del aire caliente.
2º. Flamear el asa en el mechero, poniendo el hilo al rojo vivo y
flameando el tornillo.
3º. Coger el recipiente con la muestra con la mano no dominante
 Si es un tubo, se sujeta el tapón con el meñique de la mano
dominante y se flamea la boca del tubo.
 Si es en placa de Petri, se mantiene invertida y se levanta cara
a la llama.
4º. Tomar el inóculo:
 Si es líquido, se sumerge el asa y se remueve. Se flamea de
nuevo la boca del tubo y se cierra.
 Si es en placa, se toma una porción de colonia y se cierra la
placa.
5º. Hacer la siembra según la técnica.
6º. Esterilizar el asa a la llama.

Procedimiento de siembra según el tipo de medio:
 Medio líquido: se sumerge el asa y se agita para que se desprenda el
inóculo.
 Medio semisólido: se siembra en picadura, es decir, se hunde el asa y
se retira por el mismo trayecto. Se usa para observar movilidad
(crecimiento a ambos lados de la picadura)
 Medio sólido
 En tubo con agar horizontal: por picadura
 En tubo con agar inclinado (slant o pico de flauta): se desliza el
asa por la superficie dibujando un zigzag desde el fondo hacia
la parte superior. En ocasiones se hace en dos tiempos: picadura
y zigzag.
 En placa: en medio sólido, cada célula viable dará lugar a una
colonia (UFC), por lo que se puede llegar a aislar y recontar
microorganismos.
 Siembra por agotamiento en estría: para aislamiento, hay
varias técnicas, las más usadas:
a. Estría simple: se deposita la muestra lo más lejos del
operador y se desliza en zigzag. Es importante no
volver a sembrar donde ya se ha sembrado.
b. Estría múltiple: se descarga en 3 o 4 estrías, se esteriliza
(si es asa de platino), se enfría, se extiende
perpendicularmente esas estrías, se vuelve a esterilizar
y se extiende por última vez en estrías anchas por la
zona de la placa que queda libre. Es la más usada para
aislar colonias.
Siembra en superficie, en
césped o por inundación:
para recuentos o
antibiogramas. Se añade un
volumen conocido con una
pipeta estéril en el centro
del porta y se extiende con
el asa de Digralsky. Según la
dilución se podrá contar
mejor o peor.
 Siembra incorporada, en
masa o de Barry: se vierte 1
ml de muestra en el centro
de una placa y se agregan 20
ml de medio de cultivo
fundido y termostatizado a
45º C; se agita la placa. Se
usa para recuento de UFC.


Incubación de los cultivos
La incubación se lleva a cabo en estufas de cultivo a la temperatura adecuada
para el microorganismo en cuestión. Las placas de Petri se incuban invertidas
para evitar que el vapor de agua condensado pueda quedar en la superficie
provocando un crecimiento confluente; los tubos en gradilla.
Las bacterias anaerobias estrictas no pueden vivir en presencia de oxígeno. Por
tanto debe ser excluido de la atmósfera de incubación. Puede hacerse:
 Usando agentes reductores: como el tioglicolato de sodio
 Eliminación mecánica de oxígeno y sustitución por otro gas (nitrógeno)
 Mediante reacción química: sistemas que consumen el O2 y liberan CO2.
P.ej: de forma clásica se introducía una vela.
 Con enzimas (oxirrasa) que reducen el oxígeno a agua.
Para la incubación de tubos se usan medios con agentes reductores. Se
calientan justo antes de la incubación para eliminar el oxígeno y se cierran
con tapones bien ajustados. Se puede sellar el medio con parafina estéril.
Para la incubación de placas se usa la jarra de anaerobios. Suelen ser de
plástico transparente, con abrazaderas para evitar pérdidas. Tienen
manómetro y válvulas para hacer el vacío e introducir la mezcla gaseosa
necesaria para la anerobiosis. En las más utilizadas hay un sobre en su
interior con bicarbonato de sodio y borhidruro de sodio, que al humedecerlo
se combinan con el agua produciendo H y CO2. Gracias al catalizador
paladio el H se combina con el O2 y produce agua, generando la
anaerobiosis. Tienen un indicador de anaerobiosis (azul de metileno, se
vuelve incoloro en anaerobiosis).

NORMAS DE SEGURIDAD:

 1. Es imprescindible el uso de bata de laboratorio.
 2. Al iniciar y finalizar las prácticas, el estudiante se lavará las manos con agua y jabón.
3. El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Antes de comenzar cada práctica es conveniente desinfectar la superficie de trabajo. Los desinfectantes más habituales para esto son la lejía y el alcohol (etanol 96°).
 4. Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la llama. Se deben evitar los desplazamientos innecesarios por el laboratorio, ya que pueden crear corrientes que originen contaminaciones o producir accidentes.
 5. Durante las prácticas está prohibido comer, beber y fumar. Cuando se manipulan microorganismos hay que evitar llevarse las manos a la boca, nariz, ojos, etc.
 6. Libros, carpetas, abrigos y cualquier otro material que no se utilice en la realización de la práctica deben estar apartados del lugar de trabajo.
 7. Para deshacerse del material contaminado se utilizarán los recipientes adecuados, que serán esterilizados posteriormente. Nunca se debe tirar nada contaminado por la fregadera o a la basura común.
 8. Bajo ningún concepto debe sacarse ninguna muestra contaminada del laboratorio.
 9. No se debe pipetear nunca con la boca. Utilizar siempre pipeteadores manuales.
 10. En caso de accidente (ruptura de material, derramamiento de microorganismos, etc.) se comunicará inmediatamente al instructor.

Material:
- bata y guantes
- papel de filtro
- placas o tubos
- instrumentos de siembra: asa, aguja..
- medio cultivado
- mechero
- estufa de cultivo