ESTERILIZACIÓN MATERIAL DE LABORATORIO
La esterilización del material de laboratorio es un proceso que permite eliminar la carga microbiana patógena y no patógena, incluídas las esporas, de productos e instrumentos que lo requieran como el instrumental médico o los medios de cultivo. Para que sea eficaz debe realizarse sobre materiales limpios y respetando los parámetros y procedimientos definidos para cada método.
Para decidir si un objeto debe esterilizarse o es suficiente con una desinfección pueden consultarse los criterios de clasificación del Dr. E. H. Spaulding, ampliamente aceptados por la FDA y los profesionales médicos, epidemiólogos y microbiólogos. Según esta clasificación, los objetos considerados críticos deben esterilizarse, los semi-criticos deben someterse a una desinfección de alto nivel y los no-críticos deben limpiarse y someterse a una desinfección de bajo nivel.
La esterilización puede conseguirse usando calor, productos químicos y radiación. El método a elegir dependerá del material a esterilizar y del equipo e instalaciones disponibles. Con los objetos de acero inoxidable y de vidrio podemos usar cualquier método, pero en el caso de los materiales plásticos debemos tener en cuenta su composición para evitar deformaciones e incluso la destrucción del material.
Autoclave
Es el método de referencia, utiliza calor húmedo en equipos que se denominan autoclaves, formados por un recipiente o cámara de esterilización de paredes gruesas y cierre hermético que permite usar vapor a presión y temperatura elevada. El fundamento físico es el de una olla a presión. Se considera el método más efectivo porque actúa coagulando las proteínas de los microorganismos, provocando su eliminación. Los factores más importantes en este proceso son:
La eficacia y rapidez del equipo para remover el aire de la cámara y sustituirlo por vapor evitando fluctuaciones de la temperatura.
El vapor debe proceder de agua limpia, sin contaminantes y generarse con un porcentaje de agua líquida muy bajo (menor del 3%).
El vapor debe estar en contacto directo con todo el material, el apilamiento excesivo o incorrecto pueden disminuir la eficacia del proceso.
Las piezas deben estar limpias, el vapor no penetrará una costra de suciedad.
Pueden esterilizarse en autoclave los objetos de acero inoxidable, vidrio y plásticos como el PP (polipropileno), PMP (polimetilpenteno) o PTFE/PFA (teflón).
Vía seca
La esterilización por vía seca o calor seco es una variante del autoclave en la que no se usa vapor, al ser menos agresivo (en ausencia de agua el calor se transfiere peor al material) se utiliza a más alta temperatura y durante más tiempo. El calor seco desnaturaliza las proteínas, funde los lípidos de las membranas y provoca desecación de los microorganismos.
Este método es menos corrosivo para los instrumentos metálicos y permite esterilizar sustancias en polvo o viscosas no volátiles y también las que puedan formar emulsiones con el agua.
Los objetos que pueden esterilizarse con calor seco son los metálicos, el vidrio o plásticos como PTFE/PFA (teflón) que pueden soportar la elevada temperatura del método.
Para crear unas condiciones asépticas adecuadas también usamos el mechero Bunsen:
El mechero bunsen es un instrumento utilizado en laboratorios para calentar muestras y sustancias químicas. El mechero bunsen está constituido por un tubo vertical que va enroscado a un pie metálico con ingreso para el flujo de gas, el cual se regula a través de una llave sobre la mesa de trabajo. En la parte inferior del tubo vertical existen orificios y un anillo metálico móvil o collarín también horadado. Ajustando la posición relativa de estos orificios (cuerpo del tubo y collarín respectivamente), los cuales pueden ser esféricos o rectangulares, se logra regular el flujo de aire que aporta el oxígeno necesario para llevar a cabo la combustión con formación de llama en la boca o parte superior del tubo vertical.
domingo, 4 de junio de 2017
FILTRACIÓN Y AGAR ENDO / RECUENTO DE MICROORGANISMOS 17/05/2017
Fundamentos de la técnica:
Este método se fundamenta en determinar el número y tipo de microorganismos presentes en una muestra de agua de proceso, por medio de la filtración de la misma a través de una membrana filtrante con poros de tamaño adecuado (0,45 μm de diámetro), la consiguiente retención de los microorganismos sobre dicha membrana y el cultivo de los mismos en diferentes agares de acuerdo al tipo de microorganismo.
MÉTODOS DIRECTOS
Recuento en placa
Determina el número de células microbianas viables que desarrollan colonias en el medio de cultivo usado. Cada colonia se forma a partir de una sola célula o de pequeños agregados, por lo que se habla de UFC (unidades formadoras de colonia).
Se realizan diluciones seriadas (con un factor común, 1/10 ó 1/100) de la muestra y se cultiva 1 ml de cada una de ellas. La siembra puede ser en césped o en masa, aunque en masa hay muchos microorganismos que no aguantan la temperatura.
Se incuba 24 h y se hace el recuento. Se recomienda contar las placas que presenten entre 30 y 300.
Por tanto, para saber cuántas UFC/ml hay en la muestra original:
UFC/ml =nº colonias ∙ dilución
v (ml)
Recuento por filtración
Para muestras líquidas o solubles con una cantidad de microrganismos muy baja, se hacen pasar unos 100-500 ml a través de un filtro de membrana estéril con un diámetro de poro de unos 0,45 μm. El filtro se cultiva en la superficie de un medio en placa de Petri y se incuba. Los filtros están reticulados, se contarán las colonias desarrolladas y se calcula el número de UFC/ml.
Este método es muy usado para el recuento de coliformes en análisis de alimentos y aguas.
Método del número más probable
Es un método que se basa en una estimación estadística, una distribución de tipo Poisson. Se cultivan varios tubos con distinto volumen de muestra (p.ej. 5 tubos de 0,1 g, 5 de 0,01 g y 5 de 0,001 g). Tras la incubación se anotan el número de tubos que muestran crecimiento (o una determinada reacción en el medio) y se compara en tablas que indican que el 95 % de las veces la muestra tendrá entre
unos límites inferior y superior de UFC/100 ml, indicando cuál es el número más probable.
Se usa para muestras con cargas microbianas bajas, en análisis industriales y de aguas.
Recuento directo al microscopio
Se usan portaobjetos especiales, que tienen un retículo para recontar.
MÉTODOS INDIRECTOS
Recuento por comparación con la escala de MacFarland
Para diluciones seriadas de cultivo en medio líquido. Se compara la turbidez con la escala de MacFarland, una serie de tubos de cloruro de bario precipitado con ácido sulfúrico de turbidez creciente. Esta escala indica el número estimado de bacterias/ml en función de la turbidez del tubo.
Recuento por turbidimetría
También para medios líquidos, se usa el espectrofotómetro y se estima el número de bacterias/ml en función de la luz que atraviesa la muestra (transmitancia) o absorbida (absorbancia).
Previamente se requiere realizar una curva patrón conocida, para lo cual pueden usarse los tubos de la escala de MacFarland.
Aparatos y materiales:
Equipo de Filtración
Membrana filtrante
Ampolla de agua estéril para despegar filtro
Pinzas
Mechero Bunsen
Alcohol
Pinzas para sujetar el equipo
Agua (de la que partimos para filtrar)
Placa Petri estéril con AGAR Nutritivo o ENDO
Técnica y procedimiento:
Colocaremos el papel, para evitar manchar la superficie sobre la que vamos a trabajar
Colocaremos todos los materiales a utilizar sobre dicho papel, la Placas Petri que usaremos al final de la práctica estará colocada con la tapadera boca abajo para que a la hora de cogerla sea mucho más sencillo y haya menos riesgo de contaminación.
Preparamos Equipo de filtración
Coger 100ml de Agua de la que queremos conocer las bacterias que tiene
A continuación encenderemos el mechero Bunsen para crear un ambiente estéril y para esterilizar las pinzas con las que cogeremos el filtro, esta la deberemos esterilizar con dicho mechero antes de coger el filtro, ya este podríamos contaminarlo
En una placa Petri vacía (sin AGAR) colocamos la ampolla de agua estéril y metemos dentro la membrana filtrante para que este se separe (con ayuda de unas pinzas)
A continuación coloremos la membrana filtrante en el equipo de filtración.
Colocar la campana del equipo y la pinza que la sujeta
Verter los 100ml de agua en la campana y encender el equipo.
El agua comenzará a filtrarse
Cuando ya esté el agua filtrada retiramos el filtro del aparato de filtración y lo metemos en un AGAR ENDO o Nutritivo, que posteriormente meteremos en la estufa para que crezcan los microorganismos
Sacamos el AGAR de la estufa y le hacemos un análisis macroscópico, en el que aparte de observar las colonias, tendremos que contarlas con el “contador de colonias”
CONTADOR DE COLONIAS
Un contador de colonias es un instrumento utilizado para contar colonias de bacterias o de otros microorganismos que crecen en una placa de agar. Los primeros contadores sólo eran superficies iluminadas sobre las que se colocaba la placa, con las colonias marcadas con un rotulador en la superficie externa de la placa mientras el operador realizaba el recuento manual. Los contadores más recientes intentan contar las colonias por vía electrónica, mediante la identificación de áreas individuales de oscuridad y luz, de acuerdo a los umbrales definidos por el usuario, contando los puntos en los que se aprecia contraste, o de modo automático mediante registro electrónico tras presionar con cualquier tipo de marcador
Fundamentos de la técnica:
Este método se fundamenta en determinar el número y tipo de microorganismos presentes en una muestra de agua de proceso, por medio de la filtración de la misma a través de una membrana filtrante con poros de tamaño adecuado (0,45 μm de diámetro), la consiguiente retención de los microorganismos sobre dicha membrana y el cultivo de los mismos en diferentes agares de acuerdo al tipo de microorganismo.
MÉTODOS DIRECTOS
Recuento en placa
Determina el número de células microbianas viables que desarrollan colonias en el medio de cultivo usado. Cada colonia se forma a partir de una sola célula o de pequeños agregados, por lo que se habla de UFC (unidades formadoras de colonia).
Se realizan diluciones seriadas (con un factor común, 1/10 ó 1/100) de la muestra y se cultiva 1 ml de cada una de ellas. La siembra puede ser en césped o en masa, aunque en masa hay muchos microorganismos que no aguantan la temperatura.
Se incuba 24 h y se hace el recuento. Se recomienda contar las placas que presenten entre 30 y 300.
Por tanto, para saber cuántas UFC/ml hay en la muestra original:
UFC/ml =nº colonias ∙ dilución
v (ml)
Recuento por filtración
Para muestras líquidas o solubles con una cantidad de microrganismos muy baja, se hacen pasar unos 100-500 ml a través de un filtro de membrana estéril con un diámetro de poro de unos 0,45 μm. El filtro se cultiva en la superficie de un medio en placa de Petri y se incuba. Los filtros están reticulados, se contarán las colonias desarrolladas y se calcula el número de UFC/ml.
Este método es muy usado para el recuento de coliformes en análisis de alimentos y aguas.
Método del número más probable
Es un método que se basa en una estimación estadística, una distribución de tipo Poisson. Se cultivan varios tubos con distinto volumen de muestra (p.ej. 5 tubos de 0,1 g, 5 de 0,01 g y 5 de 0,001 g). Tras la incubación se anotan el número de tubos que muestran crecimiento (o una determinada reacción en el medio) y se compara en tablas que indican que el 95 % de las veces la muestra tendrá entre
unos límites inferior y superior de UFC/100 ml, indicando cuál es el número más probable.
Se usa para muestras con cargas microbianas bajas, en análisis industriales y de aguas.
Recuento directo al microscopio
Se usan portaobjetos especiales, que tienen un retículo para recontar.
MÉTODOS INDIRECTOS
Recuento por comparación con la escala de MacFarland
Para diluciones seriadas de cultivo en medio líquido. Se compara la turbidez con la escala de MacFarland, una serie de tubos de cloruro de bario precipitado con ácido sulfúrico de turbidez creciente. Esta escala indica el número estimado de bacterias/ml en función de la turbidez del tubo.
Recuento por turbidimetría
También para medios líquidos, se usa el espectrofotómetro y se estima el número de bacterias/ml en función de la luz que atraviesa la muestra (transmitancia) o absorbida (absorbancia).
Previamente se requiere realizar una curva patrón conocida, para lo cual pueden usarse los tubos de la escala de MacFarland.
Aparatos y materiales:
Equipo de Filtración
Membrana filtrante
Ampolla de agua estéril para despegar filtro
Pinzas
Mechero Bunsen
Alcohol
Pinzas para sujetar el equipo
Agua (de la que partimos para filtrar)
Placa Petri estéril con AGAR Nutritivo o ENDO
Técnica y procedimiento:
Colocaremos el papel, para evitar manchar la superficie sobre la que vamos a trabajar
Colocaremos todos los materiales a utilizar sobre dicho papel, la Placas Petri que usaremos al final de la práctica estará colocada con la tapadera boca abajo para que a la hora de cogerla sea mucho más sencillo y haya menos riesgo de contaminación.
Preparamos Equipo de filtración
Coger 100ml de Agua de la que queremos conocer las bacterias que tiene
A continuación encenderemos el mechero Bunsen para crear un ambiente estéril y para esterilizar las pinzas con las que cogeremos el filtro, esta la deberemos esterilizar con dicho mechero antes de coger el filtro, ya este podríamos contaminarlo
En una placa Petri vacía (sin AGAR) colocamos la ampolla de agua estéril y metemos dentro la membrana filtrante para que este se separe (con ayuda de unas pinzas)
A continuación coloremos la membrana filtrante en el equipo de filtración.
Colocar la campana del equipo y la pinza que la sujeta
Verter los 100ml de agua en la campana y encender el equipo.
El agua comenzará a filtrarse
Cuando ya esté el agua filtrada retiramos el filtro del aparato de filtración y lo metemos en un AGAR ENDO o Nutritivo, que posteriormente meteremos en la estufa para que crezcan los microorganismos
Sacamos el AGAR de la estufa y le hacemos un análisis macroscópico, en el que aparte de observar las colonias, tendremos que contarlas con el “contador de colonias”
CONTADOR DE COLONIAS
Un contador de colonias es un instrumento utilizado para contar colonias de bacterias o de otros microorganismos que crecen en una placa de agar. Los primeros contadores sólo eran superficies iluminadas sobre las que se colocaba la placa, con las colonias marcadas con un rotulador en la superficie externa de la placa mientras el operador realizaba el recuento manual. Los contadores más recientes intentan contar las colonias por vía electrónica, mediante la identificación de áreas individuales de oscuridad y luz, de acuerdo a los umbrales definidos por el usuario, contando los puntos en los que se aprecia contraste, o de modo automático mediante registro electrónico tras presionar con cualquier tipo de marcador
OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS
Los organismos que pueden aparecer en un agua pueden pertenecer a dos
grandes grupos, en función de la naturaleza de sus células: eucariotas y
procariotas. Las eucariotas constituyen la unidad estructural de protozoos,
hongos, algas y metazoos (animales superiores). Son organismos unicelulares o
multicelulares que poseen en su interior estructuras limitadas por membranas
llamadas organelas u orgánulos (núcleo, mitocondrias y cloroplastos presentes
sólo en células capaces de realizar fotosíntesis).
Las células procariotas son las bacterias, y son aquellas que tienen más
importancia por las enfermedades que pueden causar. Su estructura interna es
sencilla. Etimológicamente el término procariota significa ausencia de
membrana nuclear.
Los organismos que pueden aparecer en un agua pueden pertenecer a dos
grandes grupos, en función de la naturaleza de sus células: eucariotas y
procariotas. Las eucariotas constituyen la unidad estructural de protozoos,
hongos, algas y metazoos (animales superiores). Son organismos unicelulares o
multicelulares que poseen en su interior estructuras limitadas por membranas
llamadas organelas u orgánulos (núcleo, mitocondrias y cloroplastos presentes
sólo en células capaces de realizar fotosíntesis).
Las células procariotas son las bacterias, y son aquellas que tienen más
importancia por las enfermedades que pueden causar. Su estructura interna es
sencilla. Etimológicamente el término procariota significa ausencia de
membrana nuclear.
Las bacterias son microorganismos unicelulares que se reproducen por fisión
binaria, conocida también como bipartición. Su tamaño, por lo general es
menor que el de una célula eucariota típica (por ej. Escherichia coli 0,5 × 2 μm).
Sin embargo, existe un amplio rango de tamaños según las especies que puede
variar desde 0,2 μm de diámetro como en el caso de los micoplasmas hasta 40
μm como en la Beggiatoa gigantea.
La rigidez de la pared celular determina la morfología de una célula bacteriana.
Los principales tipos de formas que presentan las bacterias son:
Cocos: de forma esférica
Bacilos: forma de bastón alargado
Espirilos: forma espiral (de sacacorchos)
Vibrios: forma de coma
Otras formas: filamentosas (ramificadas o no), de mazo...
Las células bacterianas, observadas al microscopio, pueden aparecer como
células aisladas o agrupadas:
En parejas: pueden ser diplococos o
diplobacilos
Cadenas: estreptococos o estreptobacilos
Grupos de 4: tétradas
Grupos de 8 o más: sarcinas
Racimos: estafilococos
Otras disposiciones: empalizada, forma de
letras V o L, “letras chinas”...
ESTRUCTURA DE LAS BACTERIAS
A grandes rasgos, la membrana de una célula bacteriana es similar a la
membrana plasmática de cualquier célula eucariota, es decir, una bicapa lipídica
con proteínas de membrana insertas en ella.
Sin embargo, aparecen algunas estructuras especiales:
1. Pared celular:
La pared celular bacteriana está formada por una macromolécula llama
peptidoglicano o mureína. Rodea a la membrana interna, y está presente en
todas las bacterias a excepción de algunos grupos, como pueden ser los
Micoplasmas. Dicha estructura le proporciona a la bacteria rigidez,
dotándola de su forma característica.
Sin embargo, no todas las bacterias tienen su pared celular estructurada de
la misma forma. Así, podemos distinguir dos grandes grupos de bacterias:
a. Gram +
Las bacterias identificadas como positivas en la tinción de Gram
tienen una gruesa capa de peptidoglicano rodeando a la membrana
interna. Además, en ella aparecen los llamados ácidos teicoicos
b. Gram -
Presentan membrana interna y capa de peptidoglicano, pero mucho
más delgada. Exteriormente aparece la membrana externa. Está
formada por lipopolisacárido (LPS), y en su parte más externa
presenta el polisacárido O, con capacidad antigénica (se denomina
antígeno somático, y es una endotoxina).
Entre la membrana interna y la externa existe el espacio periplásmico.
Es rico en enzimas hidrolíticas, que degradan nutrientes e inician la
digestión de los mismos para transportarlos al interior. En Gram+
esto parece ocurrir en la propia capa de peptidoglicano
2. Cápsula
Muchas bacterias presentan en la parte exterior de sus paredes celulares
otras capas que sirven de protección frente a agresiones físicas, químicas o
biológicas. Entre estas destacamos las cápsulas, que están formadas por
polisacáridos o polipéptidos y participan en la adhesión de las bacterias a
superficies, retardan la desecación de las bacterias en ambientes secos y
proporcionan protección frente a la fagocitosis.
3. Citoplasma
El citoplasma de las bacterias es similar en su composición al de las células
eucariotas. No presentan orgánulos, solamente aparecen los ribosomas,
encargados de la síntesis de proteínas.
Algunos géneros de bacterias, como Bacillus y Clostridium., tienen la
capacidad de formar endosporas, estructuras de resistencia frente a agentes
físicos y químicos.
4. Apéndices bacterianos
El flagelo, una estructura celular procariota no constante, está involucrada en la
motilidad bacteriana; es de naturaleza proteica (flagelina) y su composición
química es diferente a la del flagelo de una célula eucariota (estructura
microtubular). La disposición de los flagelos puede ser polar (localización en
uno o ambo extremos de la bacteria) o perítrica (distribución alrededor de la
superficie celular). En caso de ser polar, puede aparecer uno solo (monotrica) o
un penacho: lofotrica en un solo polo y anfitrica en ambos polos de la célula.
Los cilios son pequeñas fibras de naturaleza proteica que se encuentran en la
superficie de muchas especies de bacterias, rodeándolas.
EL MICROSCOPIO
El microscopio es un instrumento que permite observar objetos no perceptibles a al ojo humano. Esto se logra mediante un sistema óptico compuesto por lentes, que forman y amplifican la imagen del objeto que se está observando. Este término surge en el siglo XVII y deriva de las palabras griegas mikrós (pequeño) y skopéoo (observar).
Se distinguen dos tipos de microscopio, basados en el número de lentes y su posición. Estos son:
Microscopio simple: conocido comúnmente como lupa. Está constituido por una solo lente, o un sistema de lentes que actúan como si fuera una lente simple.
Microscopio compuesto: se constituye por la combinación de dos o más sistemas de lentes convergentes: uno, próximo al ojo del observador, el ocular y el otro próximo al objeto, denominado objetivo.
El microscopio compuesto consta de dos partes, una parte mecánica que tiene la finalidad de sostener la preparación a examinar y soportar todo el sistema óptico del microscopio. Y una parte óptica que considera los dos sistemas de lentes convergentes centrados sobre un eje óptico común, denominado ocular y objetivo. También esta parte integra un sistema de iluminación que facilita la observación microscópica.
Componentes de un microscopio compuesto
Pie: soporta el resto del microscopio, está constituido por una estructura metálica pesada.
Platina: es la estructura que sostiene el preparado que se desea observar.
Tubo: en él está instalado el sistema óptico. Actualmente son corrientes los aparatos binoculares (dos oculares) que facilitan la visión con los dos ojos y los revólveres portaobjetivos, con los cuales se pueden cambiar los objetivos instantáneamente, sin desenfocar la preparación. El enfoque se hace mediante unos tornillos llamados macrométricos y micrométricos, que permiten desplazamientos verticales groseros y finos, respectivamente.
Objetivos: Se insertan en el revólver del microscopio y se distinguen dos tipos:
Objetivos en seco: En éstos, el aire se interpone entre la lente y el preparado. Los objetivos más comúnmente utilizados son de 4, 10, y 40 x.
Objetivos de inmersión: Se distinguen de los anteriores porque entre la lente y el preparado se debe interponer un medio transparente con un índice de refracción (n) superior al del aire (n = 1), y semejante al del vidrio (n = 1,5). El medio utilizado es un aceite de inmersión, como por ejemplo el aceite de cedro. Son aptos para la observación de bacterias, finas estructuras, etc.
Ocular: Permite observar la imagen del objeto formada por el objetivo, actuando como una lupa. Está compuesta por dos lentes: la inferior o colectora, y la superior, o lente ocular.
Sistema de iluminación: Situado debajo de la platina, está formado por:
Lámpara ó espejo de iluminación.
Condensador: Posee la función de concentrar sobre el preparado los rayos luminosos procedentes de la fuente de luz.
Diafragma: Situado debajo del condensador, sirve para graduar la cantidad de luz que llega al objeto.
Filtros de luz: Son placas de vidrios, coloreadas, que dejan pasar las radiaciones de longitud de onda deseadas, absorbiendo las restantes.
Cuidado del microscopio
El microscopio es un valioso instrumento. Para que pueda servir eficazmente año tras año, es necesario que se le dispense el cuidado adecuado. Por este motivo, recuerde las siguientes indicaciones:
Evite mover el microscopio cuando la lámpara esté encendida, ya que el filamento de la lámpara incandescente es extremadamente sensible.
Para desplazarlo a distancia, emplee los correspondientes tornillos de fijación.
No toque las lentes de oculares y objetivos con los dedos, para evitar mancharlos con su grasitud natural.
No cambie de lugar su microscopio, ni las lentes.
Luego de usar el microscopio, límpielo con un paño de lino, libre de polvo, o con algodón hidrófilo. Verifique que no hayan quedado preparados sobre la platina.
Déjelo con el objetivo de menor aumento, la platina lo más próxima posible a él, y protegido con la cubierta correspondiente.
OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA:
conocer el funcionamiento del microscopio y observar y distinguir con él las bacterias gracias a la tinción de Gram.
RESULTADOS
Se han podido observar algunos cocos, algunos de ellos en formaciones de dos (diplococos)
OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA:
conocer el funcionamiento del microscopio y observar y distinguir con él las bacterias gracias a la tinción de Gram.
RESULTADOS
Se han podido observar algunos cocos, algunos de ellos en formaciones de dos (diplococos)
TINCIÓN DE GRAM 09/05/2017
Fundamentos de la técnica:
Es el proceso por el cual las moléculas de un colorante se adsorben a una superficie.
El uso de colorantes permite cambiar el color de las células de los microorganismos y poder realizar la observación en microscopio óptico.
Dado que las bacterias son casi incoloras, no presentan contraste con el medio en el cual se encuentran suspendidas y no pueden observarse claramente sin algún tratamiento previo.
Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram, quien la desarrolló en 1844. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, Gram positivas y Gram negativas (en este caso, los términos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga eléctrico, sino simplemente designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias).
Descripta en forma breve, la secuencia de la tinción es la siguiente: el Frotis fijado con calor se tiñe 1 min con Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con solución Yodada durante 1 - 2 min. y se lava de nuevo con agua, decolorar con mezcla alcohol etílico/acetona. Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 1 – 2 min. Lavar y secar.
Las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo así como para prevenir la lisis osmótica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el Peptidoglicano. La pared de la célula Gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de Peptidoglicano así como algo de ácido teicoico.
Generalmente, 80%-90% de la pared de la célula Gram-positiva es peptidoglicano.
La pared de la célula Gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la célula Gram-negativa es peptidoglicano
Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen, primero con una solución de cristal violeta (otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las células, tanto las Gram positivas como las Gram negativas, están teñidas de azul.
El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo-yoduro potásico. El ingrediente activo es aquí el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las células Gram positivas como las Gram negativas se encuentran en la misma situación.
Se lleva a cabo después la decoloración, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos (Gram positivos) no se decoloran, mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de células está por tanto en su resistencia a la decoloración; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias Gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipídico y disuelve la membrana exterior de la pared de la célula (y también puede dañar la membrana citoplasmática a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la célula se decolora. Las células Gram positivas, a causa de sus paredes celulares más espesas
(Tienen más peptidoglicano y menos lípido), no son permeables al disolvente, provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Después de la decoloración las células Gram positivas son todavía azules, pero las Gram negativas son incoloras.
Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules.
Técnica y procedimiento:
Colocaremos el papel, para evitar manchar la superficie sobre la que vamos a trabajar
Colocaremos todos los materiales a utilizar sobre dicho papel, la Placas Petri de la que partimos estará colocada con la tapadera boca abajo para que a la hora de cogerla sea mucho más sencillo y haya menos riesgo de contaminación Recordad poner agua en el recipiente para que el materias no adquiera el tono del colorante.
A continuación encenderemos el mechero Bunsen para crear un ambiente estéril y para esterilizar el asa de siembra, esta la deberemos esterilizar con dicho mechero antes de realizar la toma de muestra de la colonia y después de haber colocado la colonia en el Porta.
Ya nos disponemos a tomar la muestra de la colonia que se encuentra en la placa Petri cultivada, una vez que abrimos la placa Petri y antes de coger la colonia, como el asa de siembra ha sido quemada con anterioridad deberemos enfriarla en una esquina del AGAR para no quemar la colonia.
Ya tenemos la colonia en el asa de siembra
Colocar una gota de suero fisiológico en un Porta, colocar la colonia en dicha gota y disgregar.
Cuando ya tenemos la colonia bien disgregada por el porta, calentaremos el porta con el mechero Bunsen con el objetivo de fijar las colonias y que no se mueva.
Comenzamos con la utilización de reactivos
Primero añadimos un colorante a la muestra, en este caso será cristal de violeta y lo dejamos 1 minuto
Enjuagamos con agua destilada hasta que hayamos retirado todo el colorante
Añadimos Mordiente (Lugol) para fijar el color del colorante que le vamos a añadir posteriormente y lo dejamos 1 minuto.
Enjuagamos con Acetona y posteriormente con agua destilada
Le añadimos el ultimo reactivo, la Fucsina Básica, la dejaremos un minuto y enjuagaremos con agua del rifo.
A continuación dejaremos secar la muestra y le haremos un análisis macroscópico, en lo que se incluye observar la muestra en el microscopio.
Fundamentos de la técnica:
Es el proceso por el cual las moléculas de un colorante se adsorben a una superficie.
El uso de colorantes permite cambiar el color de las células de los microorganismos y poder realizar la observación en microscopio óptico.
Dado que las bacterias son casi incoloras, no presentan contraste con el medio en el cual se encuentran suspendidas y no pueden observarse claramente sin algún tratamiento previo.
Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram, quien la desarrolló en 1844. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, Gram positivas y Gram negativas (en este caso, los términos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga eléctrico, sino simplemente designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias).
Descripta en forma breve, la secuencia de la tinción es la siguiente: el Frotis fijado con calor se tiñe 1 min con Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con solución Yodada durante 1 - 2 min. y se lava de nuevo con agua, decolorar con mezcla alcohol etílico/acetona. Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 1 – 2 min. Lavar y secar.
Las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo así como para prevenir la lisis osmótica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el Peptidoglicano. La pared de la célula Gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de Peptidoglicano así como algo de ácido teicoico.
Generalmente, 80%-90% de la pared de la célula Gram-positiva es peptidoglicano.
La pared de la célula Gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la célula Gram-negativa es peptidoglicano
Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen, primero con una solución de cristal violeta (otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las células, tanto las Gram positivas como las Gram negativas, están teñidas de azul.
El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo-yoduro potásico. El ingrediente activo es aquí el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las células Gram positivas como las Gram negativas se encuentran en la misma situación.
Se lleva a cabo después la decoloración, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos (Gram positivos) no se decoloran, mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de células está por tanto en su resistencia a la decoloración; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias Gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipídico y disuelve la membrana exterior de la pared de la célula (y también puede dañar la membrana citoplasmática a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la célula se decolora. Las células Gram positivas, a causa de sus paredes celulares más espesas
(Tienen más peptidoglicano y menos lípido), no son permeables al disolvente, provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Después de la decoloración las células Gram positivas son todavía azules, pero las Gram negativas son incoloras.
Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules.
Técnica y procedimiento:
Colocaremos el papel, para evitar manchar la superficie sobre la que vamos a trabajar
Colocaremos todos los materiales a utilizar sobre dicho papel, la Placas Petri de la que partimos estará colocada con la tapadera boca abajo para que a la hora de cogerla sea mucho más sencillo y haya menos riesgo de contaminación Recordad poner agua en el recipiente para que el materias no adquiera el tono del colorante.
A continuación encenderemos el mechero Bunsen para crear un ambiente estéril y para esterilizar el asa de siembra, esta la deberemos esterilizar con dicho mechero antes de realizar la toma de muestra de la colonia y después de haber colocado la colonia en el Porta.
Ya nos disponemos a tomar la muestra de la colonia que se encuentra en la placa Petri cultivada, una vez que abrimos la placa Petri y antes de coger la colonia, como el asa de siembra ha sido quemada con anterioridad deberemos enfriarla en una esquina del AGAR para no quemar la colonia.
Ya tenemos la colonia en el asa de siembra
Colocar una gota de suero fisiológico en un Porta, colocar la colonia en dicha gota y disgregar.
Cuando ya tenemos la colonia bien disgregada por el porta, calentaremos el porta con el mechero Bunsen con el objetivo de fijar las colonias y que no se mueva.
Comenzamos con la utilización de reactivos
Primero añadimos un colorante a la muestra, en este caso será cristal de violeta y lo dejamos 1 minuto
Enjuagamos con agua destilada hasta que hayamos retirado todo el colorante
Añadimos Mordiente (Lugol) para fijar el color del colorante que le vamos a añadir posteriormente y lo dejamos 1 minuto.
Enjuagamos con Acetona y posteriormente con agua destilada
Le añadimos el ultimo reactivo, la Fucsina Básica, la dejaremos un minuto y enjuagaremos con agua del rifo.
A continuación dejaremos secar la muestra y le haremos un análisis macroscópico, en lo que se incluye observar la muestra en el microscopio.
Aparatos y materiales:
Puente de tinción
Recipiente para poner puente de tinción
Porta
Agua destilada
Agua del grifo
Asa calibrada
Mechero Bunsen
Suero fisiológico
Reactivos:
Cristal de Violeta
Mordiente (Lugol)
Fucsina Básica
SIEMBRA DE MICROORGANISMOS 02/05/2017
Objetivo:
Identificar el uso de medios de cultivo de acuerdo al microorganismo a estudiar
Fundamento:
La siembra o inoculación de un medio consiste en introducir artificialmente una
porción de muestra, llamada inóculo. Posteriormente el medio se incuba a una
temperatura adecuada para el crecimiento.
Para la siembra se pueden usar distintos instrumentos: asa de siembra, aguja de
siembra, hisopo, pipeta estéril y asa de Digralsky.
Las reglas fundamentales para efectuar la siembra exigen:
Que se efectúen asépticamente
Que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar estén esterilizados
Que se realicen solo los manipuleos indispensables
Que se trabaje fuera de toda corriente de aire. De ser posible utilizando un
mechero o bien Flujo laminar.
Procedimiento general de toma de inóculo:
1º. Colocar el material próximo al mechero encendido, creando un
espacio estéril por la ascensión del aire caliente.
2º. Flamear el asa en el mechero, poniendo el hilo al rojo vivo y
flameando el tornillo.
3º. Coger el recipiente con la muestra con la mano no dominante
Si es un tubo, se sujeta el tapón con el meñique de la mano
dominante y se flamea la boca del tubo.
Si es en placa de Petri, se mantiene invertida y se levanta cara
a la llama.
4º. Tomar el inóculo:
Si es líquido, se sumerge el asa y se remueve. Se flamea de
nuevo la boca del tubo y se cierra.
Si es en placa, se toma una porción de colonia y se cierra la
placa.
5º. Hacer la siembra según la técnica.
6º. Esterilizar el asa a la llama.
Procedimiento de siembra según el tipo de medio:
Medio líquido: se sumerge el asa y se agita para que se desprenda el
inóculo.
Medio semisólido: se siembra en picadura, es decir, se hunde el asa y
se retira por el mismo trayecto. Se usa para observar movilidad
(crecimiento a ambos lados de la picadura)
Medio sólido
En tubo con agar horizontal: por picadura
En tubo con agar inclinado (slant o pico de flauta): se desliza el
asa por la superficie dibujando un zigzag desde el fondo hacia
la parte superior. En ocasiones se hace en dos tiempos: picadura
y zigzag.
En placa: en medio sólido, cada célula viable dará lugar a una
colonia (UFC), por lo que se puede llegar a aislar y recontar
microorganismos.
Siembra por agotamiento en estría: para aislamiento, hay
varias técnicas, las más usadas:
a. Estría simple: se deposita la muestra lo más lejos del
operador y se desliza en zigzag. Es importante no
volver a sembrar donde ya se ha sembrado.
b. Estría múltiple: se descarga en 3 o 4 estrías, se esteriliza
(si es asa de platino), se enfría, se extiende
perpendicularmente esas estrías, se vuelve a esterilizar
y se extiende por última vez en estrías anchas por la
zona de la placa que queda libre. Es la más usada para
aislar colonias.
Siembra en superficie, en
césped o por inundación:
para recuentos o
antibiogramas. Se añade un
volumen conocido con una
pipeta estéril en el centro
del porta y se extiende con
el asa de Digralsky. Según la
dilución se podrá contar
mejor o peor.
Siembra incorporada, en
masa o de Barry: se vierte 1
ml de muestra en el centro
de una placa y se agregan 20
ml de medio de cultivo
fundido y termostatizado a
45º C; se agita la placa. Se
usa para recuento de UFC.
Incubación de los cultivos
La incubación se lleva a cabo en estufas de cultivo a la temperatura adecuada
para el microorganismo en cuestión. Las placas de Petri se incuban invertidas
para evitar que el vapor de agua condensado pueda quedar en la superficie
provocando un crecimiento confluente; los tubos en gradilla.
Las bacterias anaerobias estrictas no pueden vivir en presencia de oxígeno. Por
tanto debe ser excluido de la atmósfera de incubación. Puede hacerse:
Usando agentes reductores: como el tioglicolato de sodio
Eliminación mecánica de oxígeno y sustitución por otro gas (nitrógeno)
Mediante reacción química: sistemas que consumen el O2 y liberan CO2.
P.ej: de forma clásica se introducía una vela.
Con enzimas (oxirrasa) que reducen el oxígeno a agua.
Para la incubación de tubos se usan medios con agentes reductores. Se
calientan justo antes de la incubación para eliminar el oxígeno y se cierran
con tapones bien ajustados. Se puede sellar el medio con parafina estéril.
Para la incubación de placas se usa la jarra de anaerobios. Suelen ser de
plástico transparente, con abrazaderas para evitar pérdidas. Tienen
manómetro y válvulas para hacer el vacío e introducir la mezcla gaseosa
necesaria para la anerobiosis. En las más utilizadas hay un sobre en su
interior con bicarbonato de sodio y borhidruro de sodio, que al humedecerlo
se combinan con el agua produciendo H y CO2. Gracias al catalizador
paladio el H se combina con el O2 y produce agua, generando la
anaerobiosis. Tienen un indicador de anaerobiosis (azul de metileno, se
vuelve incoloro en anaerobiosis).
NORMAS DE SEGURIDAD:
1. Es imprescindible el uso de bata de laboratorio.
2. Al iniciar y finalizar las prácticas, el estudiante se lavará las manos con agua y jabón.
3. El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Antes de comenzar cada práctica es conveniente desinfectar la superficie de trabajo. Los desinfectantes más habituales para esto son la lejía y el alcohol (etanol 96°).
4. Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la llama. Se deben evitar los desplazamientos innecesarios por el laboratorio, ya que pueden crear corrientes que originen contaminaciones o producir accidentes.
5. Durante las prácticas está prohibido comer, beber y fumar. Cuando se manipulan microorganismos hay que evitar llevarse las manos a la boca, nariz, ojos, etc.
6. Libros, carpetas, abrigos y cualquier otro material que no se utilice en la realización de la práctica deben estar apartados del lugar de trabajo.
7. Para deshacerse del material contaminado se utilizarán los recipientes adecuados, que serán esterilizados posteriormente. Nunca se debe tirar nada contaminado por la fregadera o a la basura común.
8. Bajo ningún concepto debe sacarse ninguna muestra contaminada del laboratorio.
9. No se debe pipetear nunca con la boca. Utilizar siempre pipeteadores manuales.
10. En caso de accidente (ruptura de material, derramamiento de microorganismos, etc.) se comunicará inmediatamente al instructor.
Material:
- bata y guantes
- papel de filtro
- placas o tubos
- instrumentos de siembra: asa, aguja..
- medio cultivado
- mechero
- estufa de cultivo
Objetivo:
Identificar el uso de medios de cultivo de acuerdo al microorganismo a estudiar
Fundamento:
La siembra o inoculación de un medio consiste en introducir artificialmente una
porción de muestra, llamada inóculo. Posteriormente el medio se incuba a una
temperatura adecuada para el crecimiento.
Para la siembra se pueden usar distintos instrumentos: asa de siembra, aguja de
siembra, hisopo, pipeta estéril y asa de Digralsky.
Las reglas fundamentales para efectuar la siembra exigen:
Que se efectúen asépticamente
Que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar estén esterilizados
Que se realicen solo los manipuleos indispensables
Que se trabaje fuera de toda corriente de aire. De ser posible utilizando un
mechero o bien Flujo laminar.
Procedimiento general de toma de inóculo:
1º. Colocar el material próximo al mechero encendido, creando un
espacio estéril por la ascensión del aire caliente.
2º. Flamear el asa en el mechero, poniendo el hilo al rojo vivo y
flameando el tornillo.
3º. Coger el recipiente con la muestra con la mano no dominante
Si es un tubo, se sujeta el tapón con el meñique de la mano
dominante y se flamea la boca del tubo.
Si es en placa de Petri, se mantiene invertida y se levanta cara
a la llama.
4º. Tomar el inóculo:
Si es líquido, se sumerge el asa y se remueve. Se flamea de
nuevo la boca del tubo y se cierra.
Si es en placa, se toma una porción de colonia y se cierra la
placa.
5º. Hacer la siembra según la técnica.
6º. Esterilizar el asa a la llama.
Procedimiento de siembra según el tipo de medio:
Medio líquido: se sumerge el asa y se agita para que se desprenda el
inóculo.
Medio semisólido: se siembra en picadura, es decir, se hunde el asa y
se retira por el mismo trayecto. Se usa para observar movilidad
(crecimiento a ambos lados de la picadura)
Medio sólido
En tubo con agar horizontal: por picadura
En tubo con agar inclinado (slant o pico de flauta): se desliza el
asa por la superficie dibujando un zigzag desde el fondo hacia
la parte superior. En ocasiones se hace en dos tiempos: picadura
y zigzag.
En placa: en medio sólido, cada célula viable dará lugar a una
colonia (UFC), por lo que se puede llegar a aislar y recontar
microorganismos.
Siembra por agotamiento en estría: para aislamiento, hay
varias técnicas, las más usadas:
a. Estría simple: se deposita la muestra lo más lejos del
operador y se desliza en zigzag. Es importante no
volver a sembrar donde ya se ha sembrado.
b. Estría múltiple: se descarga en 3 o 4 estrías, se esteriliza
(si es asa de platino), se enfría, se extiende
perpendicularmente esas estrías, se vuelve a esterilizar
y se extiende por última vez en estrías anchas por la
zona de la placa que queda libre. Es la más usada para
aislar colonias.
Siembra en superficie, en
césped o por inundación:
para recuentos o
antibiogramas. Se añade un
volumen conocido con una
pipeta estéril en el centro
del porta y se extiende con
el asa de Digralsky. Según la
dilución se podrá contar
mejor o peor.
Siembra incorporada, en
masa o de Barry: se vierte 1
ml de muestra en el centro
de una placa y se agregan 20
ml de medio de cultivo
fundido y termostatizado a
45º C; se agita la placa. Se
usa para recuento de UFC.
Incubación de los cultivos
La incubación se lleva a cabo en estufas de cultivo a la temperatura adecuada
para el microorganismo en cuestión. Las placas de Petri se incuban invertidas
para evitar que el vapor de agua condensado pueda quedar en la superficie
provocando un crecimiento confluente; los tubos en gradilla.
Las bacterias anaerobias estrictas no pueden vivir en presencia de oxígeno. Por
tanto debe ser excluido de la atmósfera de incubación. Puede hacerse:
Usando agentes reductores: como el tioglicolato de sodio
Eliminación mecánica de oxígeno y sustitución por otro gas (nitrógeno)
Mediante reacción química: sistemas que consumen el O2 y liberan CO2.
P.ej: de forma clásica se introducía una vela.
Con enzimas (oxirrasa) que reducen el oxígeno a agua.
Para la incubación de tubos se usan medios con agentes reductores. Se
calientan justo antes de la incubación para eliminar el oxígeno y se cierran
con tapones bien ajustados. Se puede sellar el medio con parafina estéril.
Para la incubación de placas se usa la jarra de anaerobios. Suelen ser de
plástico transparente, con abrazaderas para evitar pérdidas. Tienen
manómetro y válvulas para hacer el vacío e introducir la mezcla gaseosa
necesaria para la anerobiosis. En las más utilizadas hay un sobre en su
interior con bicarbonato de sodio y borhidruro de sodio, que al humedecerlo
se combinan con el agua produciendo H y CO2. Gracias al catalizador
paladio el H se combina con el O2 y produce agua, generando la
anaerobiosis. Tienen un indicador de anaerobiosis (azul de metileno, se
vuelve incoloro en anaerobiosis).
NORMAS DE SEGURIDAD:
1. Es imprescindible el uso de bata de laboratorio.
2. Al iniciar y finalizar las prácticas, el estudiante se lavará las manos con agua y jabón.
3. El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Antes de comenzar cada práctica es conveniente desinfectar la superficie de trabajo. Los desinfectantes más habituales para esto son la lejía y el alcohol (etanol 96°).
4. Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la llama. Se deben evitar los desplazamientos innecesarios por el laboratorio, ya que pueden crear corrientes que originen contaminaciones o producir accidentes.
5. Durante las prácticas está prohibido comer, beber y fumar. Cuando se manipulan microorganismos hay que evitar llevarse las manos a la boca, nariz, ojos, etc.
6. Libros, carpetas, abrigos y cualquier otro material que no se utilice en la realización de la práctica deben estar apartados del lugar de trabajo.
7. Para deshacerse del material contaminado se utilizarán los recipientes adecuados, que serán esterilizados posteriormente. Nunca se debe tirar nada contaminado por la fregadera o a la basura común.
8. Bajo ningún concepto debe sacarse ninguna muestra contaminada del laboratorio.
9. No se debe pipetear nunca con la boca. Utilizar siempre pipeteadores manuales.
10. En caso de accidente (ruptura de material, derramamiento de microorganismos, etc.) se comunicará inmediatamente al instructor.
Material:
- bata y guantes
- papel de filtro
- placas o tubos
- instrumentos de siembra: asa, aguja..
- medio cultivado
- mechero
- estufa de cultivo
MEDIOS DE CULTIVO USADOS
- PCA
Resultado de imagen de pca agar
Medio de cultivo recomendado para el recuento de bacterias aeróbicas en aguas, aguas residuales, productos lácteos y otros alimentos. También es recomendado como medio general para determinar poblaciones microbianas.
Fundamento
La productividad de este medio, está basada en el alto contenido nutricional de sus componentes, que permite el desarrollo de las bacterias presentes en la muestra. Cuando se analiza leche y productos lácteos algunos autores recomiendan suplementarla con leche descremada estéril de uso bacteriológico en una proporción de 1 g por litro.
Incubación
Durante 24-48 horas a 32-35 °C en aerobiosis.
Características del medio
Medio preparado: ámbar claro.
Almacenamiento:
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.
- Mac Conkey Agar.
Resultado de imagen de agar macconkey
Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clínicas, de agua y alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo.
Fundamento
En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva.
Por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción en las colonias, y la precipitación de las sales biliares.
Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.
Incubación
Durante 18-48 horas, a 35-37 ºC, en atmósfera aeróbica
Características del medio
Medio preparado: rojo púrpura
Almacenamiento:
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.
- Slanetz Bartley
Resultado de imagen de slanetz bartley agar
Selección de enterococos por filtración de membrana (ISO 7899-2:2001, UNE 77-076:1991, BOE 45 de 21/2/2003 de aguas de consumo humano, BOE 259 de 29/X/2003 de aguas de bebida envasadas).
Medio selectivo indicado para aislamiento y recuento de estreptococos fecales en agua y en alimentos, con la técnica de filtración de membrana o con el método de siembra en superficie.
Siembra:
Sembrar en superficie 0.1 ml de muestra y extender con asa de Digralsky, o bien la membrana filtrada.
Incubar a 36 ºC aproximadamente, 44 horas (para mejor selectividad, a 44-45 ºC aproximadamente, preferiblemente tras 4h a 36°C aproximadamente).
- Endo Agar
Imagen relacionada
Desarrollado para el recuento de coliformes totales en agua, bebidas y otras muestras por medio de la técnica de filtración por membrana.
Fundamento
En el medio de cultivo, la pluripeptona junto con la peptona, la tripteína y el extracto de levadura, aportan los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano. La lactosa es el hidrato de carbono fermentable. El fosfato dipotásico y el fosfato monopotásico otorgan la capacidad buffer, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.
Es un medio selectivo debido al lauril sulfato de sodio y al desoxicolato de sodio que inhiben el desarrollo de la flora acompañante, y es diferencial debido a la fermentación de la lactosa.
Las bacterias fermentadoras de lactosa producen durante la fermentación aldehídos, que en combinación con la fucsina y el sulfito presentes en el medio le confieren a la colonia un brillo metálico, mientras que las colonias de las no fermentadoras son rosadas.
Siembra
- Filtrar la muestra a analizar. El volumen que se filtra depende de la probable contaminación de la muestra.
- Embeber la almohadilla con el caldo m-Endo hasta la saturación (la cantidad de medio de cultivo depende del grado de absorción de la misma).
- Apoyar la membrana filtrante sobre la almohadilla embebida con el medio de cultivo.
Incubación
Incubar las placas a 35-37 °C por 24 horas. Ocasionalmente, los microorganismos no coliformes pueden producir brillo metálico. Para confirmar las colonias sospechosas, transferirlas a tubos con caldo verde brillante y bilis al 2%, con campanitas de Durham. Incubar los tubos por 24-48 horas a 35-37 °C. Los coliformes habrán producido gas por fermentación de la lactosa, al cabo de ese período.
Resultados
El recuento debe realizarse en aquellas placas que contengan entre 20 y 80 colonias y no más de 200, ya que se trata de un medio selectivo.
La concentración microbiana debe expresarse como el número de microorganismos presentes en 100 ml de muestra.
Características del medio
El medio puede presentar turbidez y/o un ligero precipitado.
Almacenamiento
Las ampollas deben conservarse entre 2 y 8 °C.
- Agar Levine
Resultado de imagen de agar levine
Medio adecuado para la búsqueda y diferenciación de bacilos entéricos, a partir de muestras clínicas, aguas servidas, y otros materiales.
Es recomendado por la American Public Health Association, para el análisis microbiológico de productos lácteos y alimentos, y por la USP para la realización de los ensayos límite microbiológicos.
Fundamento
La fórmula original de este medio de cultivo, fue modificada por Levine, eliminando la sacarosa e incrementando la concentración de lactosa, lo que permite una mejor diferenciación de E. coli.
Es un medio selectivo y diferencial, adecuado para el crecimiento de enterobacterias.
La combinación utilizada de eosina y azul de metileno, inhibe el desarrollo de microorganismos Gram positivos y de bacterias Gram negativas fastidiosas, y también, permite diferenciar bacterias fermentadoras y no fermentadoras de lactosa.
Los microorganismos fermentadores de lactosa, originan colonias de color azulado-negro, con brillo metálico. Las colonias producidas por microorganismos no fermentadores de lactosa son incoloras.
Algunas bacterias Gram positivas (cepas de estafilococos, enterococos) y levaduras, pueden crecer, originando
colonias incoloras y puntiformes.
Este medio de cultivo,es útil para la orientación y no confirmación de especies bacterianas (ya que numerosas cepas de Citrobacter spp. producen colonias con brillo metálico), por lo cual será necesario realizar pruebas bioquímicas, para la identificación de género y especie.
Incubación
De 18-24 horas a 35-37 °C, en aerobiosis.
Características del medio
Medio preparado: color púrpura con tonos verdosos, ligeramente opalescente con un precipitado floculento disperso.
Placas preparadas: color púrpura.
La esterilización del medio de cultivo reduce el azul de metileno al color naranja. El color púrpura se restaura por agitación. La presencia de un precipitado en el medio esterilizado es normal y no debe ser removido, ya que es parte esencial del mismo.
Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.
MEDIOS DE CULTIVO 31/03/2017
En el laboratorio existen dos técnicas básicas para trabajar con
microorganismos: el cultivo para crecerlos y la microscopía para verlos.
Para poder trabajar con microorganismos lo primero que tenemos que hacer es
crecerlos, cultivarlos en medios de cultivo, para poder así obtener una gran
cantidad de microbios, poder aislarlos y tenerlos en cultivo puro, para su
posterior estudio. Los medios de cultivo son materiales alimenticios, naturales
o artificiales, que contienen los nutrientes y las condiciones físico-químicas
necesarias para el desarrollo y crecimiento de los microorganismos.
Robert Koch fue el primero que cultivó bacterias en medios sólidos. Primero
empleó rebanadas de patata, pero se le contaminaban fácilmente con hongos
ambientales. Luego empleó gelatina para solidificar los medios, pero algunos
microorganismos son capaces de degradarla. Además, la gelatina no se mantenía
sólida a 37ºC, que es la temperatura a la que crecen la mayoría de los patógenos
humanos. La idea de emplear agar la sugirió Fanny Eilshemius, la mujer
de Walter Hesse, unos de los colaboradores de Koch, en 1882. Fanny
empleaba agar para solidificar las mermeladas y Walter se llevó el invento de la
cocina al laboratorio. La ventaja del agar es que permanece sólido a 37ºC, la
mayoría de las bacterias no la degradan y además es trasparente, lo que facilita
el examen de las colonias bacterianas. Llevamos más de 120 años usando el agar
para preparar los medios y obtener cultivos puros bacterianos. Algo tan sencillo
como los medios sólidos con agar en placas de Petri ha sido esencial para el
desarrollo de la microbiología.
UTILIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:
a. Separación y aislamiento de microorganismos presentes en una muestra.
b. Paso previo para la identificación de un microorganismo problema. Se
pueden obtener cultivos puros (axénicos) a partir de colonias aisladas.
c. Conocer el tipo de metabolismo: en función de los nutrientes que utiliza
o los metabolitos que produce.
d. Estudios macroscópicos, es decir, de las características de las colonias en
medio sólido.
e. Realización de antibiogramas.
f. Pruebas de concentración mínima inhibitoria (CMI)
g. Conservación de especies
COMPOSICIÓN DE UN MEDIO DE CULTIVO
1. Nutrientes energéticos:
a. Fuente de carbono: puede aparecer como sustancias muy sencillas
(ácido acético, alcohol, citrato sódico…), de monosacáridos y
disacáridos (glucosa, lactosa…) o en forma más compleja (almidón). El
uso de unas moléculas u otras es muy útil para su identificación
bioquímica y clasificación taxonómica.
b. Fuente de nitrógeno: es menos energética pero necesaria. La proporcionan
las proteínas, péptidos o aminoácidos. Suele incluirse en forma de gelatina,
extractos de carne, peptonas...
2. Nutrientes no energéticos:
a. Agua: indispensable, ha de ser destilada para no alterar el equilibrio de
sales. En los medios con agar recién preparados, la evaporación o
tiempo de almacenamiento excesivo puede reducir la actividad del agua
de la superficie, produciendo colonias más pequeñas o inhibiendo el
crecimiento.
b. Sales minerales: proporcionan equilibrio osmótico para evitar la lisis o
deshidratación de los microorganismos, y aportan micronutrientes. Se
añaden sales de sodio, potasio, magnesio, hierro…
c. Fuente de azufre: generalmente en forma de sulfatos, tiosulfatos y
aminoácidos azufrados como la metionina.
d. Fuente de fósforo: en forma de fosfatos.
3. Otros componentes:
a. Agentes solidificantes: en los medios sólidos y semisólidos. El agar, un
polisacárido obtenido de algas rojas, es el más usado. La gelatina y la
albúmina apenas se usan pues son consumidos por la mayoría de los
microorganismos.
b. Tampones: para estabilizar el pH
c. Indicadores de pH: según el pH del medio tienen un color u otro (rojo
neutro, azul de bromotimol, fenolftaleína…)
d. Agentes reductores: para promover la anaerobiosis en el medio, se usa
tioglicolato sódico, ácido ascórbico, cisteína…
e. Factores de crecimiento: para ciertas especies se necesitan ciertos
compuestos especiales, como vitaminas, purinas o pirimidinas.
f. Factores inhibidores: impiden el crecimiento de algún tipo de
microorganismos. Existen muchos sustratos de este tipo:
Inhibidores de Gram-: azida sódica
Inhibidores de Gram+: eosina-azul de metileno, cristal violeta, verde
brillante
Inhibidores de microorganismos no entéricos: sales biliares
Antibióticos.
TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO
Según su consistencia
a. Líquidos (caldos): no contienen agar, se preparan en tubos. Favorecen
el desarrollo y multiplicación de las bacterias por la fácil difusión de los
nutrientes.
b. Sólidos: contienen agar en una proporción de 15-17 g/l. También pueden
tener gelatina o albúmina. Se preparan en tubo inclinado o placa. El
crecimiento es más difícil, son muy buenos para aislamiento, morfología
de colonias, producción de hemólisis…
c. Semisólidos: con agar entre 3-5 g/l, suelen ir en tubo. Para movilidad de
microorganismos.
Según su composición
a. Definidos: su composición química es totalmente conocida.
b. Complejos: compuestos por mezclas de extractos de materiales naturales
cuya composición química exacta no es conocida. Los clásicos estaban
compuestos por clara o yema de huevo, patata, suero sanguíneo… En la
actualidad se combinan los extractos naturales (levadura, carne, peptonas
hidrolizadas…) con adición de constituyentes químicamente definidos.
Según su utilidad
a. Medios generales o comunes: apropiados para el crecimiento de la
mayoría de microorganismos poco exigentes. Ejemplos: caldo nutritivo,
caldo triptona-soja (TSB), PCA...
b. Medios enriquecidos: se les añade ciertos productos para favorecer a
microorganismos más exigentes (sangre, suero, glucosa). Ejemplos: agar
lactosado, agar sangre...
c. Medios selectivos: llevan sustancias enriquecedoras e inhibidoras que
permiten el desarrollo de algún tipo microbiano. Por ejemplo, el agar bilis
verde brillante.
d. Medios diferenciales: incluyen algún componente que da información
adicional por medio de reacciones bioquímicas (azúcares, indicadores de
pH, colorantes).
Muchos de los medios son tanto selectivos como diferenciales, como el
agar MacConkey o el agar Levine, selectivos para Gram- y diferencial entre
fermentadores de lactosa y no fermentadores.
e. Medios de transporte y conservación: para asegurar la viabilidad de los
microbios desde la toma de muestras hasta la siembra en laboratorio, envío
de unos laboratorios a otros y mantenimiento de cepas durante largos
periodos de tiempo. Son medios no nutritivos que inhiben las reacciones
enzimáticas autodestructivas y evitan los efectos letales de la oxidación.
Los más usados son el Stuart, Amies y Cary-Blair.
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO 23/04/2017
En la actualidad, la mayoría de los medios de cultivo se comercializan ya
preparados y esterilizados.
Sin embargo, existe la posibilidad de comprarlos liofilizados. En estos casos la
preparación del medio de cultivo se reduce sencillamente a pesar la cantidad
deseada del mismo y disolverla en agua destilada siguiendo las instrucciones del
fabricante. Posteriormente se esterilizan, generalmente por calor húmedo en el
autoclave, excepto aquellos que contengan componentes termolábiles, que se
esterilizan por filtración.
Según el recipiente en que se vaya a distribuir, se seguirá el siguiente orden:
En tubo: se reparten en los tubos antes de ser esterilizados. Se reparten
2-4 ml en caso de medios líquidos y unos 6-8 ml cuando sean tubos de
agar inclinado. En este último caso, tras la esterilización, se dejarán
apoyados en una superficie inclinada hasta que solidifiquen en forma de
slant o punta de flauta.
En placa de Petri: se esterilizan en botella o matraz Erlenmeyer. Una vez
esterilizados, se deja enfriar sin que llegue a solidificar para
posteriormente repartirlos en las placas en condiciones de esterilidad. Se
almacenarán en posición invertida.
Objetivos:
Preparar medios de cultivo como soporte y fuente de nutrientes para el desarrollo de los microorganismos
Fundamento
El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de los microorganismos. La composición precisa dependerá de la especie que se quiera cultivar, porque las necesidades nutricionales varían considerablemente. Hay microorganismos muy poco exigentes que crecen bien en medios de laboratorio normales y microorganismos muy exigentes que necesitan determinadas sustancias como vitaminas, suero o sangre para crecer.
Durante las prácticas se van a manejar medios de cultivo de composición muy variada y de tres tipos diferentes en cuanto a consistencia:
Medios sólidos: Se pueden preparar a partir de medios líquidos a los cuales se les añaden agentes solidificantes como agar, gelatina o sílica gel. Se utilizan con frecuencia en el aislamiento y mantenimiento de los microorganismos en el laboratorio. Ej. Agar nutritivo.
Semisólidos
Líquidos: Usualmente se denominan caldos ya que contienen los nutrientes disueltos en agua. Permiten obtener suspensiones con un elevado número de microorganismos. Ej. Caldo nutritivo
Este último aspecto es importante a la hora de la preparación de los mismos. Aunque los medios artificiales o sintéticos se pueden preparar a partir de sus componentes individuales, se pueden adquirir comercialmente como medios deshidratados a los que solamente hay que añadir la cantidad de agua necesaria. El fabricante indica la composición, la caducidad, y la cantidad que debe pesarse por cada litro a preparar e incluso como debe esterilizarse.
La preparación de medios de cultivo a groso modo consistiría en: Se siguen las instrucciones del rótulo del medio de acuerdo a la cantidad a preparar. Se transfiere el medio a u Erlenmeyer y se agrega la cantidad de agua destilada establecida. Con ayuda de un vigilante se disuelven los grumos que puedan formarse y se lleva la suspensión a baño maría hasta que el medio se torne transparente, se cubre el Erlenmeyer con un tapón de algodón (torunda) envuelto en gasa. Se cubre la torunda con material impermeable y se esteriliza en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. Si se utiliza de inmediato, dejar enfriar a temperatura alrededor de 45ºC. En caso de que el medio solidifique, fundirlo nuevamente a baño maría antes de su uso.
En el caso del caldo Mc Conkey, se siguen las instrucciones del rotulo, y se distribuye el caldo colocando 10 ml en tubos de ensayo de 20 y 10 ml en tubos de ensayo de 50. Se coloca previamente en los tubos una campana de Durham invertida. Se tapan los tubos y se esterilizan en autoclave durante 15 minutos a 121ºC.
TÉCNICA Y PROCEDIMIENTO:
- Limpiar superficie, antes y después, con agua y lejía.
- Cálculo y peso de agar.
- Medir agua en probeta.
- Mezclar en el Erlenmeyer (microondas).
- Autoclave.
1º Realizar los cálculos necesarios para conocer la cantidad de AGAR que hay que pesar
K.I.A:
1000ml ________54,5g
70ml __________ x
2º Colocaremos el papel, para evitar manchar la superficie sobre la que vamos a trabajar
3º Colocaremos todos los materiales a utilizar sobre dicho papel
4º Mediremos el agua destilada que vamos a necesitar para la realización de medio, para esto y en este caso utilizaremos una Probeta
5º Nos dirigimos hacia el peso, asegurándonos de que este éste encendido y limpio, colocaremos un vidrio de reloj sobre el peso, a continuación pulsaremos el botón “Tarar”, a partir de aquí ya podremos proceder a verter lentamente con ayuda de una espátula el AGAR que necesitamos sobre el vidrio de reloj, hasta conseguir la cantidad necesaria, una vez obtenida dicha cantidad los restos que se encuentren en la espátula no podremos volver a verterlos sobre el bote de soluto, lo verteremos sobre un vaso de precipitado, que usaremos para los restos. Recordad cerrar bien el bote de AGAR para evitar que este se derrame y/o contamine.
6º A continuación nos volvemos a dirigir a la mesa de trabajo que dejamos preparada anteriormente, con ayuda de la misma espátula usada con anterioridad verteremos el AGAR pesado en un matraz Erlenmeyer que previamente le habremos añadido un poco del agua que teníamos preparada en la Probeta
7º Una vez que hemos añadido todo el AGAR sobre el Matraz Erlenmeyer terminaremos de añadir el agua destilada de la Probeta.
8º Ya tenemos la preparación del AGAR casi terminada, a continuación después de haber mezclado el AGAR (gelificánte) lo moveremos con una varilla agitadora para eliminar los grumos.
9º Una vez que podemos dar la mezcla por terminada tendremos que calentarla hasta su ebullición, esto se realizara en un microondas (tener cuidado ya que esto tarda muy pocos segundos)
10º Sacamos el medio del microondas, y lo añadimos en uno de estos materiales según la finalidad del medio, en caso de que su estado sea liquido o semisólido en tubo tendremos que añadir el medio con ayuda de un pipeta graduada con su pimpum correspondiente en tubos de ensayos (colocados en gradillas metálicas) que posteriormente esterilizaremos en autoclave y tras su esterilización lo colocaremos en tubo s de ensayo de tal forma que al enfriarse se nos quede con la forma que necesitamos para la realización de la prueba a la que está destinada ese tipo de AGAR. En otros casos en los que el estado final del medio sea semisólido/solido tendremos que colocar el medio en una placa Petri, que solo tendremos que dejar enfriar.
11º En todos estos casos es importante rotular el material, ya sea el tubo de ensayo como la placa Petri, para así conocer el medio de cultivo y que no podamos confundirnos a la hora de realizar el cultivo.
- AGAR (polvo)
- Agua destilada
- Placa Petri o tubos de ensayo
- Gradilla metálica para los tubos de ensayo
- Vidrio de reloj
- Probeta
- Matraz Erlenmeyer
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